بیولومینسانس چیست؟

انتشار نور از جانوران و گیاهان همیشه برای بشر جذاب و شگفت انگیز بوده است و تحقیق در مورد چگونگی این پدیده دغدغه‌ی بسیاری از طبیعتدانان، فیزیولوژیست‌ها و فیزیکدانان بوده است. رابرت بویل در قرن 17 میلادی با ساخت یک پمپ خلا نشان داد که لومینسانس ( نشر نور ) از قارچ‌ها نیازمند هوا است ودر خلا، نور منتشر نمی‌شود.

واژه‌ی لومینسانس را اولین بار Eilhardt wiedman در سال 1888 خلق کرد که به معنی انتشار نور سرد است. منظور از نور سرد این است که کمتر از 20 درصد تابش حرارتی تولید می‌شود و لومینسانس یا نور سرد نباید با فلورسانس، فسفورسانس و یا شکست نور اشتباه شود. در سال 1916 Harvey واژه‌ی بیولومینسانس را که به معنی لومینسانس از موجودات زنده است را به کار برد.

بیولومینسانس تولید و نشر نور، در اثر انجام یک واکنش شیمیایی- آنزیمی، از موجودات زنده است و بر خلاف واکنش‌های زیستی معمول، که انرژی به صورت گرما به محیط داده می‌شود، انرژی این واکنش به انرژی نورانی مبدل می‌شود.

بیولومینسانس در موجودات مختلف با اشکال ظاهری متنوع و با مکانیسم‌های مختلف انجام می‌شود. برخی جانوران اندام‌های نورانی پیچیده‌ای که مانند چشم است دارند، در این جانوران انتشار نور تحت کنترل سیستم عصبی است و نور بر اساس نیاز یا باتحریک عصبی آزاد می‌شود. از جمله این جانوران ماهی منور و اقتاپوسهای نور افشان است. در برخی دیگر یک سلول منفرد همه‌ی دستگاه‌های مورد نیاز برای نشر نور را دارد و نور به طور ممتد نشر می‌شود ( باکتری‌ها و قارچ‌های منور از این دسته هستند ). بسیاری از گروه‌های دیگر موجودات لومینسانس حد واسط این دو گروه اند. 

در مکانیسم تولید نور سرد ممکن است دستهٍ‌ای از واکنش‌های بینابینی نیز وجود داشته باشد اما واکنشی که تولید نور می‌کند واکنش نهایی مسیر است که به آن ‎« واکنش منتشر کننده‌ی نور » می‌گویند که در این واکنش از مولکول ناشر نور یک الکترون منفرد به حالت برانگیخته می‌رسد. واکنش‌های منتشر کننده‌ی نور متنوعی وجود دارد اما همه‌ی آنها شامل یک واکنش اکسیداسیون سوبسترا (مولکول ناشر نور )، که معمولاً پروتئینی به نام لوسیفرین است، می‌شود. این واکنش اکسیداتیو انرژی لازم برای برانگیختگی الکترون فراهم می‌کند.

اهمیت تکاملی بیولومینسانس

بیولومینسانس در موجوداتی که از این ویژگی بهرمنداند دارای اهمیت تکاملی است و می‌توان کاربردهای زیر را به طور عمده برای آن برشمرد:

1. وسیله‌ای برای استتار- برای مثال کوسه‌ی کوکیکاتر با لومینسانس سرتاسر بدن خود را نورانی می‌کند جز ناحیه‌ای در زیر شکمش که تاریک باقی می‌ماند. این قسمت تاریک همانند ماهی تُن به نظر می‌رسد و باعث جلب ماهی‌های شکارچی می‌شود و به این ترتیب با این طعمه‌ی فریبنده، ماهی شکارچی خود طعمه‌ی کوسه‌ی کوکیکاتر می‌شود.

2. به عنوان وسیله‌ی دفاعی- دیانوفلاژلت‌ها زمانی که حمله‌ی شکارچی‌هایشان را حس می‌کنند با لومینسانس باعث جلب شکارچی‌‌های بزرگتر نیز می‌شوند که شکارچی‌های اولیه را شکار می‌کنند و دیانوفلاژلت‌ها را از خورده شدن نجات می‌دهند.

3. جلب طعمه – anglerfish برای جلب طعمه از لومینسانس استفاده می‌کند.

4. جلب جفت- کرم‌های شب تاب در فصل جفتگیری با تابش نور جلب جفت می‌کنند.

5. برای برقراری ارتباط- این استفاده از بیولومینسانس بیشتر در کلونی‌های باکتری‌های لومینسانس کننده دیده می‌شود. 

جانورانی که از حس بینایی برای دریافت اطلاعات از محیط استفاده می‌کنند گاهی در به کارگیری از این حس در تاریکی با مشکل مواجه می‌شوند. برای رفع این مشکل جانوران سازش‌های مختلفی پیدا کرده‌اند.

 برخی مثل جغدها از چشم‌های خیلی بزرگ برای جمع‌آوری نور استفاده می‌کنند. همچنین جانوران از حس‌های دیگرشان برای جمع‌آوری اطلاعات از محیط استفاده می‌کنند. انسان برای مقابله با تاریکی به اختراعات مختلف دست زده است از جمله ساخت لامپ‌ها رشته‌ای و چراغ قوه‌ها. بسیاری از جانوران از نوری که خودشان تولید می‌کنند به عنوان چراغ برای روشن‌سازی محیطشان استفاده می‌کنند. مزیتی که این نور بر نورهای ساخت دست بشر دارد این است که برای ایجاد آن احتیاج به برافروختگی الکتریکی که در نتیجه‌ی آن گرمای زیادی تولید می‌شود و هدر می‌رود نیست چراکه این جانوران از واکنش‌های شیمیایی و نور سرد برای روشن‌سازی محیطشان استفاده می‌کنند.

تعداد زیادی از موجودات منتشرکننده‌ی نور ساکن دریا هستند با این حال تعداد معدودی از آنها در خشکی و زیستگاه‌های آب شیرین نیز یافت می‌شوند. موجودات بیولومینسنت همزیست با مجودات دیگر نیز جز این گروه محسوب می‌شوند. بیولومینسانس در هر جانداری از نظر طول موج نور، مدت تابش، تناوب و دفعات تابش منحصر به فرد است. در زیر با برخی از موجودات بیولومینسنت آشنا می‌شویم.

از جمله جانداران خشکی‌زی:

 از گروه حشرات می‌توان کرم شب تاب یا firefly را نام برد که آشنا ترین مثال از موجودات منتشرکننده‌ی نور است.

هزارپایِ Luminodesmus

حلزون Quantula

Archnocampa از کرم‌های تابنده است 

Mycena lampadis یک قارچ بیولومینسنت است. روشنایی که این قارچ در تاریکی کامل ایجاد می‌کندبرای مطالعه‌ی روزنامه کفایت می‌کند:

حدود نود درصد موجودات ساکن در اعماق دریا تولید بیولومینسانس می‌کنند. از جمله آبزیان بیولومینسانت:

Anglerfish :قسمتی از نخاع پشتی در جنس ماده‌ی این ماهی به درون بدن برآمده شده که با انتشار نور طعمه را به سمت دهان جلب می‌کند.

Black dragonfish :در طول پیکر این ماهی فتوفور‌هایی در دو ردیف پراکنده شده‌اند که در روشن کردن مسیر حرکتش به آن کمک می‌کنند. در جنس ماده یک زائده‌ی چانه‌ای وجود دارد که نوک آن لومینسانس ضعیفی دارد و در جلب طعمه به کار گرفته‌ می‌شود:

هشت‌پای رنگین کمانی:

Aequorea victoria که نوعی ماهی ژله‌ای یا عروس دریایی است:

دیانوفلاژلیت‌ها، dianoflagellates ، از تک سلولی‌های آبزی تابنده اند:

کاربرد بیولمینسانس

در بین روش‌های سنجشی مورد استفاده در تحقیقات زیستی، روش‌هایی که بر اساس نشر نور عمل می‌کنند به دلیل حساسیت بالایی که دارند و سهولت کاربردشان در بین محققان محبوب‌تر اند.

این روش‌ها بر این اساس که انرژی مورد نیاز برای تولید فتون چگونه تامین می‌شوند دسته بندی می‌گردند. برای مثال روش‌های فتولومینسانس به این دلیل اینگونه نامگذاری شده‌اند که منبع انرژی برای برانگیختگی الکترون فتون است ویا در کمولومینسانس منبع انرژی شیمیایی است ،  رادیولومینسانس  بر پایه‌ی رادیواکتیویته است و الکترولومینسانس که الکتریسیته تامین کننده‌ی انرژی برانگیختگی است.

بیولمینسانس شکلی از کمولومینسانس است که واکنش تولیدکننده‌ی نور از یک فرایند کاتالیز آنزیمی، برای مثال واکنش آنزیم لوسیفراز بر روی لوسیفرین در کرم شب تاب، مشتق می‌شود.

در همه‌ی اشکال کمولومینسانس، انرژی به وسیله‌ی ملکول ساتع کننده‌ی نور جذب می‌شود و سبب برانگیخته‌ شدن مولکول می‌شود. زمانی که مولکول به حالت پایه یا اولیه‌ی خود بر می‌گردد انرژی اضافی به صورت نور خارج می‌شود. اما تفاوت بین انواع لومینسانس‌های شیمیایی در این است که چگونه حالت برانگیخته ایجاد می‌شود. در شکل زیر تفاوت بین بیولومینسانس و فلورسانس نشان داده شده است:

استفاده از واکنش‌های بیولومینسانس به عنوان ابزارهای سنجش در زمینه‌های مختلف علم و فناوری روز به روز گسترده‌تر و محبوب‌تر می‌شود. برای مثال سیستم بیولومینسانس کرم شب تاب که عموماً به عنوان روشی برای اندازه‌گیری ATP ( آدنوزین تری فسفات) ،که یک مولکول ناقل انرژی در واکنش‌های سوخت و سازی حیاتی است، استفاده می‌شود.

پروتئین‌های حساس به کلسیم در ماهی ژله‌ای ، از قبیل آکوآرین (aequorin) به طور گسترده‌ای در نشان دادن کلسیم داخل سلولی، که تنظیم کننده‌ی بسیاری از واکنش‌های مختلف سلولی است،  استفاده می‌شود.

پروتئین لومینسنت دیگری که از ماهی ژله‌ای همراه با آکوارین استخراج و کشف شده است، پروتئین سبز  (GFP; green fluorescent protein) است که استفاده از آن به طور وسیعی در حال گسترش است و به عنوان یک نشانگر با کارایی بالا برای سلول‌های زنده در تحقیقات زیستی و همچنین ابزاری در تشخیص‌های پزشکی مورد استفاده قرار می‌گیرد.

 رایج‌ترین کاربرد بیولومینسانس در تحقیقات علوم زیستی، استفاده از آن به عنوان گزارشگرهای ژنتیکی، به طور مثال برای فرابینی دینامیک نسخه برداری ژنتیکی، است. لوسیفراز کرم شب تاب معمولا بهترین گزینه برای این منظور است. لوسیفراز کرم شب تاب یک پروتئین 61 کیلودالتونی تک پار است که برروی لوسیفرین، ATP و اکسیژن اثر کرده و در نتیجه‌ی این واکنش نور سبزـ زرد با طول موج 560 تولید می‌شود.

آنچه که سبب روی آوردن به استفاده از پُروب‌ها یا کاوشگرهای بیولومینسانس می‌شود برتری‌های این روش نسبت به استفاده از پروب‌های دیگر نظیر افزودن فلوروفور‌ها است که در بخش بعدی این مجموعه به شرح آن می‌پردازیم.

مزایای کاربرد بیولومینسانس

همان طور که در قسمت سوم این مجموعه بیان شد از بیولومینسانس در سنجش‌های زیستی ، که با ابعاد و اهداف وسیعی صورت می‌گیرد، می‌توان استفاده کرد و به دلیل برتری‌هایی که نسبت به روش‌های دیگر سنجش دارد، تکنیک‌های بیولومینسانس روزبه روز گسترده‌تر و پرکاربردتر می‌شود. در این مقاله به بررسی برخی جنبه‌های سنجش‌های مبتنی بر بیولومینسانس و مقایسه‌ی آن با روش‌های دیگر سنجش، می‌پردازیم.

1. مطالعات فیزیولوژیکی بر روی سیستم‌های زنده

در مطالعات فیزیولوژیکی معمولاً برای بررسی یک فرایند حیاتی از ردیاب‌های وارد شونده به سلول استفاده می‌شود. این نوع ردیاب‌ها که عمدتاً  نوعی مولکول فلوروفور یا رادیوایزوتوپ است از طریق واردشدن یا اختلاط یافتن با یک واکنش سلولی ویژه عمل می‌کنند. از این رو حضور آنها می‌تواند بر فرایند مورد بررسی تاثیر گذارد  و به طور بالقوه منجر به بروز رفتارهای تقلیل یافته یا مصنوعی شوند. بنابراین نتایج حاصل چندان قابل اعتماد نمی‌باشند.

ردیاب مورد استفاده در سنجش‌های فیزیولوژیکی باید کمترین اثر را  بر فرایند مورد بررسی داشته باشد تا سبب ایجاد استرس فیزیولوژیک در جاندار مورد مطالعه نشود.

یکی از بهترین راه‌ها برای به حداقل رساندن اثرات ردیاب‌های وارد شونده به سلول و کاهش احتمال ایجاد استرس فیزیولوژیک ناشی از ورود یک ماده‌ی خارجی به سلول، استفاده از آنها در غلظت‌های پایین می‌باشد.

ردیاب‌های فلوروفور به این ترتیب عمل می‌کنند که با دریافت فتون معرفی شده به آنها تحریک شده و با نشر فتونی با انرژی کمتر، دوباره به حالت اولیه‌ی خود بازمی‌گردد. زمانی که ابزار سنجش زیستی مولکول فلوروفور باشد، از اندازه‌گیری شدت فتون‌های نشری توسط دستگاه‌های اسپکتروفتومتری برای گزارش بررسی استفاده می‌شود.

در استفاده از فلوروفور‌ها، «نور پس زمینه» می‌تواند سبب بروز خطا در نتیجه‌ی اعلام شده توسط دستگاه اسپکتروفتومتر گردد. «نور پس زمینه» را دو عامل ایجاد می‌کند:

• فتون‌های تحریک کننده اولیه

• فلوروفورهای ضعیفی که به طور طبیعی در سیستم‌های زیستی وجود دارند

آشکار کننده‌ی نوری دستگاه باید متحمل تشخیص نور نشری از فتون‌های تحریک کننده و نور تداخلی حاصل از فلوروفورهای زیستی، گردد.

همانطور که در بالا گفته شد برای کاهش تاثیرات ردیاب در فرایند زیستی مورد بررسی توصیه می‌شود که غلظت را کم کنند. اما در مورد سنجش‌های فلوروژنیک کاهش غلظت ردیاب که در اینجا یک فلوروفور است سبب غالب شدن نور پس زمینه به نور نشری می‌شود و متعاقباً میزان خطای نتیجه افزایش می‌یابد.

اینجاست که تکنیک‌های بیولومینساسی با حساسیت بالایشان به کمک می‌آیند. از آنجاکه در اینجا عامل تحریک کننده برای نشر نور، یک برهمکنش شیمیایی است نه یک فتون و همچنین طول موج نشری مشخص و قابل اندازه‌گیری بدون نیاز به استفاده از فیلتر‌های تک فام کننده‌ است، مشکل نور پس زمینه دیگر وجود نخواهد داشت. ضمن اینکه عامل منتشر کنند‌ه‌ی که پروتئین لوسیفرین است در فرایند فیزیولوژیک مورد بررسی دخالت نمی‌کند و وارد آن نمی‌شود. به علاوه ناشر نور یک مولکول زیستی است و سبب برهم خوردن تعادل سیستم حیاتی سلول نمی‌شود.

2. تعیین ویژگی‌های سلول‌های زنده در کشت‌های سلولی

تعیین ویژگی‌های سلول‌های زنده در کشت‌ یک مشکل بسیار اساسی است. هنگامی که اثر  مواد تنظیم کننده‌ی رشد و همچنین عوامل سمی مورد مطالعه‌ است اهمیت تکنیک مورد استفاده بیشتر می‌شود. اندازه‌گیری تعداد سلول‌های زنده در کشت از جنبه‌های اساسی سنجش زیستی در شرایط آزمایش است.

نوکلئوتید آدنوزین تری فسفات (ATP) نقش مهمی در مبادله‌ی انرژی در سیستم‌های بیولوژیک ایفا می‌کند. ATP  به عنوان دهنده‌ی اصلی انرژی در همه‌ی فعالیت‌های متابولیکی سلول حضور دارد. بیشتر ATPای که در سلول زنده یافت می‌شود فرایند‌های کاتابولیسمی ( تجزیه کننده و انرژی زا ) و آنابولیسمی ( سازنده و انرژی خواه ) را به هم پیوند می‌دهند.

نظر به اینکه همه‌ی سلول‌ها به ATP نیاز دارند تا زنده بمانند و عملکردهای ویژه‌یشان را انجام دهند بنابراین اندازه‌گیری ATP اساس مطالعه‌ی فرایند‌های حیاتی است. از این رو ATP به عنوان ابزاری برای بررسی عملکرد سلول‌های زنده استفاده می‌شود.

روش‌های زیادی برای تعیین ATP استفاده می‌شود که موفق‌ترین‌ آنها تکنیک‌های بیولومینسانس است چراکه حساسیت بالا و دامنه‌ی پویایی گسترده‌ای دارند. «تکنیک بیولومینسانس ATP» برای تعیین سطوح ATP در تعدادی از انواع متفاوت سلولی استفاده می‌شود.

واکنش شیمیو لومینسانس‌ که توسط آنزیم لوسیفراز حاصل از حشره‌ی شب تاب ( Photinus pyralis ) کاتالیز می‌شود به صورت زیر است:

منیزیم و ATP ، پروتئین لوسیفرین را به شکلی تبدیل می‌کنند که قابل اکسید شدن کاتالیتیکی توسط آنزیم می‌باشد و از اکسید شدن لوسیفرین پرتویی با طول موج 562nm ساتع می‌شود.

تحت شرایط بهینه‌، شدت نوری که منتشر می‌شود با غلظت ATP رابطه‌ی خطی دارد. برای اندازه‌گیری ATP، سلول را با کمک مواد تخریب کننده‌ی غشا، از قبیل دترژنت‌ها، لیز می‌کنند. این عمل باعث رها شده ATP به محیط کشت می‌شود. با افزودن لوسیفرین و لوسیفراز، در حضور ATP نور 560nm منتشر می‌شود که با اندازه‌گیری شدت نور توسط اسپکتروفتومتر غلظت ATP را تعیین می‌کنند. به سبب حساسیت بالای آنزیم لوسیفراز، در این روش سنجش زیستی ، ATP با حداقل غلظت 50*10-18 مول قابل اندازه‌گیری است.

در حال حاضر تلاش‌هایی برای استفاده از «تکنیک بیولومینسانس ATP» برای تعیین میزان تکثیر و بررسی مسمویت سلولی حاصل از دو ماده‌ی متفاوت، در موجود زنده، برای جلوگیری از استفاده‌ی رادیوایزوتوپ‌ها صورت می‌گیرد.

رادیوایزوتوپ‌ها در پزشکی هسته‌ای برای درمان و تشخیص انواع سرطان و مراحل آن به کار می‌رود. به این منظور استفاده از رادیوایزوتوپ‌های تابش‌کننده‌ گاما سودمندتر است. اشعه‌ی گامای ساتع شده از این مواد میزان پیشرفت سرطان در بافت‌های بدن را مشخص می‌کند.

با توجه به اثراتی که تشعشعات هسته‌ای می‌تواند بر مولکول‌های زیستی بگذارد از جمله یونیزاسیون، ایجاد انواع رادیکال‌های آزاد و جهش زایی، استفاده‌ی تشخیصی از این پرتوها می‌تواند همراه عوارض متعدد مانند تخریب بافت مغز استخوان و در نتیجه کم خونی همچنین تاثیر بر روی سیستم گوارش، غدد تناسلی، مغز و غیره در فرد مورد آزمایش شود و علائمی نظیر سرگیجه، بی‌اشتهایی، تعریق شدید و اختلال تنفسی را به دنبال داشته باشد. ضمن اینکه این تشعشعات در دراز مدت خود می‌توان عاملی برای ایجاد سرطان باشد.

از این رو استفاده‌ از تکنیک‌های بیولومینسانس برای تشخیص‌های طبی، با توجه به طبیعی و بدون عارضه بودن آنها از یک سو و حساسیت بالای آن از سوی دیگر می‌تواند جایگزین بسیار مناسبی برای روش‌های مبتنی بر رادیوایزوتوپ‌ها باشد.

نویسنده: سمانه سادات عنایتی