Reverse Transcriptase PCR ( RT- PCR

تعدادی از آنزیم های پلیمراز بجای DNA  از RNA  بعنوان سوبسترا استفاده میکنند واز روی RNA  یک رشته DNA سنتز میکنند.  رشته جدید سنتز شده را cDNA  میگویند و واکنش بنام نسخه برداری معکوس Reverse transcription)) گفته میشود. آنزیمهایی که ار RNA بعنوان سوبسترا استفاده میکنند Reverse trnscriptase معروف هستند.

آنزیم  Tth  که از باکتری ترموس ترموفیلوس  بدست می آید  در حضور یون منگنز فعالیت  Reverse trnscriptase و در حضور یون منیزیوم فعالیت   DNA polymerase   دارد. آنزیم  AMV  که از یک نوع ویروس پرندگان بنام Avian Myeloblastosis Virus  trnscriptase  استخراج میگردد فعالیت  RNase H هم دارد. دمای مطلوب فعالیت آن 42 درجه است و برای تهیه  cDNA با طول کمتر از 500 b  استفاده میگردد. آنزیم MMLV ازیک نوع ویروس  جوندگان بنام Mouse Molony Leukemia Virus   استخراج میشود و فعالیت RNase H آن کمتر از آنزیم قبلی میباشد . در 37 درجه فعالیت میکند . آنزیم Superscript  آنزیم MMLV مهندسی شده است که ژن قسمتی که فعالیت RNAse H  دارد را از آن حذف کرده اند و برای تهیه cDNA بزرگ استفاده میگردد. 
انجام RT-PCR:

1- مقدار 10 میکرولیتر از RNA  مرحله قبل را RT-PCR  استفاده کنید

RNA                                  10 μl

RT buffer                          4 μl

RT enzyme                       0.5 μl

RNasine                           0.3 μl

dNTP                                1 μl

primer (1&2)                     20pmol

DEPC water                    up to 20 μl

قبل از اضافه کردن RNA مدت 10 دقیقه آن را در 70 درجه قرار دهید تا از تشکیل لوپ جلوگیری شود. واکنش را یک ساعت در 42 رجه قرار دهید و سپس 5 دقیقه در 94 قرار دهید تاRT  غیر فعال شود وآنزیم پلیمراز را مهار نکند. سپس به هر لوله مقدار 0.25 μl آنزیم پلیمراز اضافه کنید و با برنامه زیر واکنش را 30 سیکل ادامه دهید:

Denaturation                    94^o                   30 sec

Annealing                         55^o                         30 sec

Extension                         72^o                         30 sec

 برای واکنش Nested   مقدار یک میکرولیتر از محصول PCR  استفاده کنید

Taq poly                                       0.25 μl

10 x PCR buffer                            5 μl

Mg Cl2                                          1.5 μl

Primer (F&R)                               3 μl

DNA                                              1 μl

dH2O                                            up to 50 μl

واکنش را مختصری سانتریفیوژ کنید وبا برنامه زیر واکنش را 30 سیکل ادامه دهید:

Denaturation                    94^o                   30 sec

Annealing                         57^o                         30 sec

Extension                         72^o                         30 sec

در انتها مدت  5 دقیقه آن را دردمای 72 درجه قرار دهید

واکنش را با ژل آگارز 3 درصد الکتروفورز کنید ( پرایمرها تعداد 250bp  را از ناحیه 5`UTR ویروس هپاتیت C را آمپلی فای میکنند.